新品 | NK细胞高效扩增试剂盒
日期：2025-07-01 阅读：
产品描述
人NK细胞高效激活扩增试剂盒支持冻存和新鲜人源PBMC和CBMC来源NK细胞的体外高效激活和扩增。试剂盒整合了NK细胞活化与扩增所必须的重要信号通路因子，以及维持和延长NK细胞活性的关键细胞因子，能够高效扩增并活化出高纯度的NK细胞，是纯蛋白因子方法大量制备具有肿瘤杀伤活性的NK细胞的强大工具。
产品信息
使用方法
一、实验前准备
1.1 耗材:T25 培养瓶(TC处理培养瓶，如Corning 430639);T75、T175 培养瓶，移液管、离心管等耗材，Takara GT-T610(A)细胞培养袋;
1.2 试剂:20%HSA，Ficoll分离液，DPBS，NK 试剂盒;
1.3 设备:迷你离心机，大容量离心机，水浴锅;
1.4 样本筛选:如果需要大规模扩增NK 细胞，需要进行前期样本种子筛选。外周血 NK 含量大于 15%，脐带血采集量大于100mL，确保离体运输时间控制在8小时之内。如果做自体NK细胞培养，可以不参考样本筛选要求。
二、d0 天实验注意事项
2.1收到试剂盒，将因子和基础培养基添加物放置于-20℃保存，培养基存放于4℃;
2.2 取T25 培养瓶一个，加入5mLDPBS，取包被因子一支融解，融解后用迷你离心机瞬时离心(减少粘壁损失)，加入到DPBS 中混匀，封口膜封口后置于4℃冰箱，静置16h 以上，第二天使用，或者置于 37°C培养箱中快速包被 2h 以上。
三、d0 天 NK 细胞制备分离、激活
3.1 新鲜采集外周血或脐带血40mL~50mL;
注意:脐带血推荐采集总量>90mL(含28mL抗凝剂)，只需要取50mL用于本体系培养，试剂盒只适配 50mL起始血量，剩余的可以 Ficoll 分离后冻存单个核细胞;
3.2 Ficoll 分离液，如从冰箱取出，务必复温到室温;
3.3 配制洗液 DPBS+5%HSA，如:237.5mLDPBS+62.5mLHSA(20%浓度);
3.4 自体灭活血浆制备:取抗凝血40-50mL转移到50mL离心管，全血以1000g，离心15 min;离心完毕,吸取上层血浆到50mL离心管;水浴锅56℃,30min 灭活血浆;灭活后,置于-20℃存放 15min,再次离心 2100g，离心30min，取上层血浆至离心管，4℃保存备用。
注:如果脐带血上层血浆有较多红细胞，则血浆再以2100g，10min 离心，离心完毕吸取上清;如脐带血和外周血用于大量培养体系，为避免血小板污染和血浆的其他影响因素，则不使用自体血浆，直接用 AB 血清或血替替代，则本血浆制备步骤跳过;如脐带血采集量小于90mL，则不使用自体血浆用血替替代，跳过血浆制备步骤。
3.5 NK 细胞分离纯化:
a、分离前样本及各试剂应室温预温至20℃，15-25℃室温离心。
b、样品采集后应在8h 内分离NK细胞，好是即采即提。脐带血采集袋中含有枸橼酸钠，长期保存对NK 细胞有毒性，离体运输时间过长容易导致培养失败。
c、将血浆提取步骤中所得的下层细胞样本用配制的洗液按照1:1稀释,轻轻吹打混匀,加入一支1.5mL纯化因子，轻轻颠倒混匀5次，室温孵育 20min后，再用等量的稀释液(DPBS+5%HSA)进行重悬，轻轻颠倒混匀，不可吹打。取50mL离心管，各加入15mL 的 Ficoll 溶液，按照2:1的比例将血液小心加入到 Ficoll 上层，注意保持液面分层，1200g离心20min，缓升缓降，缓升为1，缓降为0。
注:脐带血中含有较多未成熟红细胞，容易在Ficoll 分离时离心不下来。建议50mL 离心管加入20mL Ficoll，按照 1:1 的比例加入20mL稀释后的血液，然后离心。
3.6 NK 细胞分离制备:小心吸取白膜层到预加洗液20mL的50mL离心管，300g，离心 10min(缓升8，缓降6);弃上清，重复如上步骤再洗涤一次，离心后上清留样做无菌检测;
用预温至37C的培养基(分装10mL 无血清NK基础培养基，培养箱预温，原代接种用该分装的培养基)重悬细胞，取样进行细胞计数。
如供者血细胞中 NK含量较少(<10%)则得到的白膜层细胞会较少，注意区分白膜层位置并标记，上下都多留多吸一些液体，可多吸一些Ficoll层，以尽可能多吸取细胞;
关键质控点:取Ficoll 分离后的细胞，做流式检测，分析CD3-CD16+CD56+细胞占比;
3.7 取预先包被的 T25培养瓶，倒掉包被液后备用。(建议 5mL 洗液清洗包被面。注意:加液时不要冲刷包被面)
3.8 D0 天激活:细胞总数量在2-20E6之间都统一加入10mL分装预热的初始培养基，轻轻吹打混匀，加入10%灭活自体血浆，加入一支200ul 刺激因子1。(在离心管混匀后，将细胞悬液移入包被好的T25瓶中，注意加液时不要冲洗包被面)稍待细胞沉降，显微镜下观察并拍照。置于培养箱静置培养三天。3天内可不用进行观察以便细胞成团生长，如细胞量较多(大于1E7)，则d2 天观察以便确定是否可以扩瓶到T75。
注:脐带血或者外周血如果Ficoll 分离后细胞量比较多,则多10mL初始培养基只需要接种多 2E7 的细胞，剩余细胞可以冻存备用。接种细胞数量过多，则容易导致细胞死亡成团。
四、d3 扩瓶到T75
4.1 适度轻轻吹散细胞转移到T75，此时不计数不做流式检测;
4.2 配制扩增用完全培养基:基础培养基添加物20mL用37℃水浴锅融解,添加到1LNK 基础培养基，并加入一支扩增因子，形成扩增用完全培养基;
4.3 取一支刺激因子2，融解后置于4℃，按1000X 比例加入到细胞中(如1mL培养液中加入1ul);
4.4 T25 瓶中如有较多贴壁细胞，首先将细胞悬液转移到T75培养瓶后，拍打瓶身T25 培养瓶，使其脱落(显微镜观察脱落情况)，而用移液管很难吹打下来;确认脱落后，用20mL完全培养基洗涤T25瓶，加入到T75中，补加10%自体血浆 2mL+20ul刺激因子2，至此T75 瓶终体积为30mL。
五、d4 T75 转移到T175
将T75 瓶中的 30mL 细胞转至T175中(用25mL移液管轻轻吹打，分散大的克隆团)，将贴壁细胞拍下来，如上T25操作，再补加60mL，加5%自体血浆3mL+60ul刺激因子2，至此 T175 的终体积为93mL。
六、d5 补液
T175 培养瓶补液60mL，补加5%自体血浆 3mL+60ul 刺激因子2，共150mL。关键质控点:取样3mL 计数并做流式检测NK含量CD3-CD16+CD56+;
七、d6 T175 一扩二
轻轻吹打 T175 细胞悬液，吸取 75mL细胞悬液到新的T175培养瓶，各补加75mL新鲜培养基，并补充 5%自体血浆。需待培养基颜色微黄再扩袋，这样细胞密度较为合适。如果细胞数量少，可以延迟一到两天扩袋。
八、d7 两瓶 T175 转到610 (A)培养袋
两瓶 T175 共 300mL细胞悬液+新鲜培养基300mL，将瓶子中贴壁的细胞拍打下来，洗涤后加入袋子，补加 1%自体血浆，共600mL(折叠培养);剩余血浆按照1%进行补液时添加，直至用完;
注:如果需要大量培养NK 细胞，推荐先用悬浮细胞培养瓶T225(每瓶多250mL)进行扩瓶培养，扩瓶后再一对一入袋培养。
九、d9 补液
600mL 原细胞液再补加600mL新鲜完全培养基，注意培养基需要预温到室温，不可反复37°℃预热，补液后细胞液体积为1200mL。
注意:补液前需要计数细胞数量，使得补液后细胞密度不低于 1E6/mL。
十、d10 补液
补液 300mL到1500mL。
十一、d11 等量扩袋，取样计数做流式检测NK
补液前取样进行细胞计数和流式检测NK细胞纯纯度度，建议重新取一610(A)培养袋，从个培养袋中转移 750mL 到新的培养袋，两个培养袋各等量补液750mL，每袋1500mL;
十二、d13 隔天等量补液
如需放大培养则隔天进行1:1扩袋，如自体细胞需要回输，则d14 天可以收获细胞。
十三、d14 根据客户需要的细胞数量，继续培养或者收获细胞
13.1 如需收获细胞则充分拍打细胞培养袋，使沉底细胞脱落;
13.2 计数并进行流式检测、杀伤实验等;
13.3 收获计数时建议采用 AOPI 染色计数，细胞计数仪对于成熟杆状的NK 细胞容易漏计;
13.4 为获得更多的细胞数量，后一次补液后可以隔两天再进行细胞收获。
十四、如需继续大规模培养，则建议每隔一天等量补液，可以扩增到新的培养袋中，以便扩大培养体积，更
优选择是用WAVE 系统进行培养，灌流以获得更大细胞培养密度。
14.1 外周血自体血浆用完后可以不用再添加血替;
14.2 脐带血全程用血替，如果要大量培养整个培养过程都建议后期维持1%的血替添加量;
14.3 如果要测试长期扩增效果，可以从d14 天之后，取75mL细胞悬液到T175悬浮培养瓶，模拟长时间大规模培养的效果，进行换算得到d28天的数据;
14.4 d20 天之前入袋后，隔天补液细胞密度调整至补液后1-1.2E6/mL;d20 天之后间隔2天补液一次，或细胞密度调整至补液后1.3-1.5E6/mL;
14.5 根据细胞需求量，可以持续培养到d28 天。自 d14 天之后到 d28 天，每天可以根据客户细胞需求情况决定是否部分收获细胞，满足客户即时需求，无需等待。
十五、流式圈门设定原则
首先根据前向角散射光信号(FSC)和侧向角散射光信号(SSC)设门圈出目标细胞分群1，然后根据同型对照组荧光强度，在分群1的基础上标记出阳性细胞群2，排除没有被茨光抗体标记的阴性细胞。
抗体同型对照作为阴性对照，根据CD3-CD45+CD56+可界定 NK 细胞群，随后从 NK 细胞中分析CD107a、颗粒酶B、穿孔素的阳性比例。进一步检测CD16+CD56+比例。具体步骤可参考NK 细胞团体标准。
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