新品 | NK细胞高效扩增试剂盒
日期：2025-02-24 阅读：
产品描述
货号：91-02-0135
NK细胞扩增试剂盒培养基为初始培养基，为无血清培养基，不含水解物，NK细胞扩增试剂盒培养基含有谷氨酰胺和葡萄糖。
产品信息
使用方法
包被
将包被液加入对应培养载体容器内，轻摇使包被液均匀铺满瓶底。之后水平放置于4℃冰箱避光静置，包被12~18h后即可使用。使用前吸出包被液，用DPBS洗涤一次包被瓶。
Day0，第0天
1.样本血浆分离及灭活
1.1.开启水浴锅，温度设置为56°C。
1.2.供者外周血50mL~100mL（其中10mL用于血常规和传染病检测），将采集的血样转入50mL离心管。
1.3.700g离心10min（离心机升9降6）。
1.4.用移液器吸取上层淡黄色血浆于一个新的50mL离心管并标识。
1.5.将标识好的离心管用封口膜封口，放入56°C水浴锅中，热灭活30min。
1.6.2000g以上高速离心10min。吸取上清于新的离心管，即刻转入4℃冰箱。
2.PBMC分离
2.1.用移液管将下层的血细胞与生理盐水1:1混匀，按2:1（血细胞悬液：Ficoll）将血细胞悬液沿离心管管壁缓慢加入装有Ficoll的离心管内。
2.2.将离心机升降速调至低，700g离心20min。
2.3.离心结束后，用移液管吸取中间白膜层置于新的50mL离心管，加入40mL生理盐水混匀，700g离心5min洗涤两次，以去除血小板等杂质。
3.NK特异性诱导
3.1.提前配制NK细胞培养基，并预热至37℃备用。
3.2.PBMC前处理（仅针对单采PBMC样本，其他样本不需要执行该步骤）
3.2.1.贴壁处理：一般将PBMC按1×10^8cells添加20mLNK细胞培养基，重悬后静置贴壁2h。
3.2.2.贴壁处理后，将未贴壁的PBL收集到离心管后，用生理盐水洗涤2次培养瓶，将所有细胞悬液一并收集至离心管中，400g离心10min后，弃去上清。
3.3.用NK细胞培养基重悬PBL，取样计数。
3.4.将细胞悬液转移至抗体包被好的T75培养瓶中（使用kit因子1包被），根据细胞计数结果，补加激活细胞培养基、终浓度10%（Vol）已灭活自体血清或血小板裂解物，接种细胞密度控制为1.5-2*10^6/mL（激活时培养温度可设定到38.5℃培养4h）。
Day3，第三天
1.将激活细胞培养基放至37℃培养箱进行预热。
2.取出培养的NK细胞，根据细胞生长状态添加1~2倍体积的激活细胞培养基。
Day5，第五天
1.将NK培养基放至37℃培养箱进行预热。
2.取出培养的NK细胞，将培养瓶内细胞悬液转移至50mL离心管，并使用移液管取新鲜的NK培养基轻轻冲洗培养瓶底部，以尽可能收集贴壁细胞。
3.400g离心5~8min，去除上清液。以去除抗体和激活因子，避免细胞刺激过度。
4.用少量（5~10mL）NK培养基重悬，混匀取样计数。
5.根据计数结果进行计算，加入激活细胞培养基和终浓度5%的已灭活自体血清或血小板裂解物，按1.2~1.5×10^6接种至新的75T或175T培养瓶继续培养。
Day7~D14/D21
1.第7天，将NK培养基放至37℃培养箱进行预热。
2.取出培养的NK细胞，显微观察及取样计数，离心之后（400g离心5~8min），按照0.8~1×10^6/mL密度添加扩增细胞培养基和终浓度5%的已灭活自体血清或血小板裂解物。
3.之后每隔一天，取出培养的NK细胞，显微观察及取样计数，按照0.8~1×10^6/mL密度添加扩增细胞培养基。
4.培养至D14时细胞总量一般能到达2×10^9以上，长培养时间为21天，当细胞量到达需求量时，离心收获细胞，经检测合格后，按需求使用。
注意事项
1.NK kit因子1~3需要存储在-20℃及以下，当使用时进行溶解，并在1个月以内用完。
2.NK细胞扩增试剂盒培养基含有谷氨酰胺，超过3个月需要额外补加2mM。
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